Metoda de cercetare genetica moleculara

Pentru a explora și identifica variante în structura ADN-ului metoda genetica moleculara utilizate. Pentru fiecare regiune de ADN, care explorează această regiune a cromozomului, gena sau alela, metodele difera. La baza fiecărei metode genetice moleculare cuprinde o parte sau alta manipulare a ARN și ADN. Toate aceste metode sunt caracterizate de o complexitate enormă, fără condiții de laborator nu pot fi efectuate, iar personalul trebuie să fie de înaltă calificare. Această activitate se desfășoară în mai multe etape.

etape

Mai întâi, ARN sau ADN probe pentru a fi produse. Aici, o metoda genetica moleculara poate fi aplicat la orice material virtual: o picătură de sânge, leucocite, fibroblastele de cultură, mucoasa (fragmentat), chiar foliculilor de par, - ADN-ul poate fi obținut din orice probă. Este adecvat să se folosească orice metode genetice moleculare și diferite opțiuni lor și au ADN-ul lung izolat este stocat congelat. A doua etapă este dedicată acumulării fragmentelor dorite (amplificare) a ADN-ului, deoarece aceasta ajută la asigurarea reacției în lanț a polimerazei in vitro (in vitro, fără implicarea organismului viu). Ca rezultat, selectat multiplies fragment ADN prin această reacție în lanț, și crește cantitatea de ADN literalmente milioane de ori.

Al treilea pas in moleculare metodele de cercetare genetică presupune restricție multiplicată ADN (această fragmentare, ruperea sau tăierea). Restricție realizată prin electroforeză pe poliacrilamidă sau gel de agaroză. Aceasta metoda moleculara genetica de a studia fragmentului ADN permite tuturor să ia o anumită poziție în gel. După aceea, gelul este tratat cu bromură de etidium, capabil de legare la ADN, iradierea cu lumină ultravioletă, atunci este posibil să se observe porțiuni luminescență. metode de diagnostic genetice moleculare sunt variate și numeroase, dar primele două etape sunt comune tuturor. Dar, în scopul de a identifica fragmente de ADN, gelul poate fi colorat, și multe alte metode existente.

specie

Metodele cele mai directe și răspândite pentru detectarea micobacteriilor poate include metoda de mai sus moleculara invatare ADN genetice. Esența ei este că, pentru a identifica materialul lanț de scanare a unor fragmente de ADN de agenți patogeni. Tehnici de diagnostic genetice moleculare nu au încă un mod mai eficient de a recunoaște astfel de boli ca tuberculoza. Folosind reacția în lanț a polimerazei (PCR), puteți fi sigur că ADN-ul original, va crește numărul de copii într-un milion de ori, adică, vor exista amplificare, și va afișa rezultatele. Nivelul de sensibilitate este foarte mare - mai mult de nouăzeci și cinci la sută, care este principalul avantaj al acestei metode.

Restul metodelor moleculare genetice de cercetare asupra eficienței randamentului copii multiple literalmente dublat, deoarece, în acest caz, eșantionul de redactare prezintă o secvență de oligonucleotide specifică crescută la o sută de șase ori. Chiar și diagnosticul de cultură a tuberculozei a sistemului respirator inferior în mod semnificativ sensibilitatea. Acesta este motivul pentru care medicina modernă se bazează pe metode genetice moleculare de diagnostic a tuberculozei. O metodă descrisă este eficientă mai ales atunci când se ocupă cu agenți patogeni de variabilitate antigenică ridicată, determină că un alt mod este mult mai dificilă - necesită speciale medii nutritive și cultivarea de mult timp. metode genetice biochimice și moleculare produc efecte foarte diferite asupra rezultatelor.

diagnosticul de tuberculoză

Diagnosticul Marshall PCR al tuberculozei cel mai frecvent folosind acele secvențe de ADN, care sunt specifice pentru toate cele patru tipuri de boala. Pentru atingerea acestui scop folosesc adesea primeri care detectează secvența IS elemente (IS-986, IS-6110), deoarece aceste elemente caracterizează specii mari migratoare Mycobacterium tuberculosis și întotdeauna prezente mai multe copii in genomul. De asemenea, extracția ADN-ului poate fi realizată din culturi pure si clinice (spută de pacienți) prin orice altă metodă adecvată. De exemplu, metoda Boom acolo unde tamponul de liză este utilizat pe baza tiocianat de guanidină și silice ca ADN-ul purtător. Numărul de pacienți cu diferite bacteriologică săracă în creștere în fiecare an, și, prin urmare, în practica clinică a stabilit un nivel complet diferit de organizare: metoda genetica moleculara pentru studiul ADN-ul a jucat un rol major la diagnostic.

Cu toate acestea, trebuie să admitem că nu este lipsit de dezavantaje. Metoda PCR este utilizarea de multe ori aduce un număr foarte mare de rezultate fals-pozitive, iar motivul este nu numai erori tehnice, dar și caracteristicile metodei în sine. În plus, folosind această metodă de diagnostic pentru a determina viabilitatea micobacteriilor, care au fost identificate, este pur și simplu imposibil. Dar acest dezavantaj nu este cel mai important. Metodele moleculare genetice de diagnostic PCR implica riscul de contaminare a ADN-ului micobacteriene. Cerințele de certificare pentru acest motiv, pentru laboratoarele de PCR proiectate exclusiv din greu, au nevoie de trei spații distincte. Tehnologia PCR este modernă și foarte complexă, necesită utilizarea unui echipament adecvat și personal instruit de mare.

bacterioscopia

În cazul în care rezultatele analizei diagnostic trebuie să fie comparate cu alte date: examen clinic, radiografie, examen microscopic, cultură și chiar ca răspuns la un tratament specific sunt foarte importante. În această serie, studiile PCR este doar una dintre componentele. Detectarea agentului patogen în diagnosticul precoce poate fi cele mai simple și mai rapide metode - bacteriologice.

Se utilizează un microscop optic (colorarea Ziehl-Neelsen) și fluorescente (fluorocromi colorat). Avantajul este viteza frotiu rezultatele. Dar dezavantaj este considerat pe bună dreptate, capacitatea limitată din cauza sensibilității scăzute. Cu toate acestea, această metodă este dată recomandarea OMS ca fiind cel mai economic și la sol pentru a detecta pacientii cu tuberculoza. Detectarea micobacteriilor metode bacteriologice are o valoare de predicție și estimată excretie cantitativ bacteriană. Mult mai încrezător pentru a face cu ea moleculare metode de cercetare genetice ale tuberculozei.

culturi

O mai bună detectare a micobacteriilor recunosc studiile culturale. Însămânțarea materialului patologic este făcută în mediul ou: Mordovsky, Finn II, LJ, și altele asemenea. Standarde de rezistență micobacteriilor la medicamente și dovezi indirecte ale eficacității unui număr de micobacterii și coloniile lor in vitro, dacă metoda aplicată culturii cercetării. Pentru a crește procentul de izolare de inoculare micobacteriilor materialului patologic se desfasoara pe mai multe medii.

Satisfacerea nevoilor de numeroase, inclusiv patogen de grant și fluide culturale. Folosit în acest sistem și automatizat de tip contorizare de creștere VANTES. Culturile trebuie să aibă loc în incubație timp de până la șapte până la opt săptămâni. Prin acest timp, cultura cu lipsa de creștere poate fi considerat negativ. Cel mai eficient mod de a detecta Mycobacterium tuberculosis ia în considerare probe biologice: porci de guineea de diagnostic materiale, care infectează sunt extrem de sensibile la TB.

unele cifre

domeniu interesant de studiu, care a fost deschis de diagnosticare PCR a fost de a studia tuberculoza M. - infecții latente. Conceptul modern de infectie TB sugereaza ca dintr-o sută de oameni care au fost în contact cu M. tuberculosis, nouăzeci și ar putea fi infectat, dar numai zece dintre ele sunt boala activă este în curs de elaborare. Alții au imunitate TBC, și pentru că nouăzeci la sută din cazuri infecția rămâne latentă. Detect un model a ajutat o metoda genetica moleculara.

Geneticienii spun că cincizeci și cinci la sută din cei ale căror culturi patologice materiale au fost negative, optzeci la suta din persoanele infectate cu M. tuberculosis, dar care curge fără manifestări radiologice ale bolii, PCR a primit răspunsuri pozitive. Este o metodă de diagnostic genetic a ajutat la identificarea pacienților cu risc de studii PCR, cu rezultatele analizelor lor (microscopie și cultură) au fost negative, iar infecția subclinică M. tuberculosis a fost prezent.

moderne de cercetare

Federația Rusă și laboratoarele bacteriologice folosesc o metodă accelerată a concentrațiilor absolute: Reductaza nitrat de micobacterii testate de reactiv Griess. Centrele anti-TB folosi o metodă care permite determinarea rezistentei la medicament. Această însămânțare în mediu lichid, unde automatizate radiometrică și sistemul de contabilitate fluorescente creștere micobacterii. O astfel de analiză se face rapid - până la două săptămâni.

În prezent, sunt în curs de elaborare noi metode: rezistenta la medicamente micobacteriilor se măsoară la nivelul genotipului. Studiul mecanismelor moleculare ale genelor de rezistență și arată prezența în micobacterii. Aceste gene sunt asociate cu rezistenta la anumite medicamente. De exemplu, genele Kasa, INHA, katG rezistente la izoniazidă, gena rpoB - gene rifampicina ARN 16Sp și rpsL - streptomicină, emb1 - ethambutol, girA - un fluorochinolonelor și așa mai departe.

mutații

Diagnosticul modern, a crescut în mod semnificativ nivelul de metoda genetica moleculara de a studia ADN-ului și a permis să efectueze studii la scară largă a mutațiilor în toate spectrul lor. Acum știm că cele mai frecvente mutații în 516, 526 și 531 codonii genei rpoB, precum și rezistența identificate la diferite medicamente. Există o serie întreagă de metode pentru tipizarea micobacteriilor folosind nu numai metode tradiționale - biochimice, biologice si culturale, dar, de asemenea, utilizate pe scară largă tehnici moderne de genetica moleculara. Deja sunt adecvate și furnizează metoda diagnostic corect pentru detectarea bolilor monogenice. Ele se bazează pe studii ADN în zona exactă a unei anumite gene. Acesta este de obicei un proces complex, consumatoare de timp și costisitoare, dar datele care sunt furnizate de analiza genetica moleculara, este mult mai precise și informative decât datele tuturor celorlalte analize.

Acesta a fost mult timp cunoscut faptul că ADN-ul nu se schimba pentru întreaga viață a organismului, care este, în orice odnakova celulele nucleate, iar acest lucru face posibil să se ia analiza absolut toate celulele corpului, în orice stadiu al ontogenie. Gena deteriorat poate fi detectată înainte de apariția primelor simptome la scară largă bolii clinice, precum si la persoanele heterozigote sănătoși, dar care au o mutatie in gena. metodele de diagnostic genetic boli ereditare moleculara permite sa dezvaluie sale (abordare directă, ADN-diagnosticare), precum și pentru a analiza segregarea bolii în familie cu ADN marker de loci (polimorfisme genetice), care sunt strâns legate de o genă deteriorată (de exemplu, abordarea indirectă a ADN-diagnosticare). În mod direct sau indirect - orice diagnostic ADN-ului se bazează pe metodele de identificare a unei porțiuni strict definită a ADN-ului uman.

metode directe

Metode directe de diagnostic ADN-ului sunt atunci cand gena culprit boli ereditare cunoscut sub numele de bine cunoscute tipuri de mutatii sale. De exemplu, o metode directe adecvate într-un număr de boli. Acest coreea Huntington (extensie CTG-repetiții), fenilcetonuria (R408W), fibroza chistica (delF508, mutații majore) și altele asemenea. Principalul avantaj al metodei directe este o precizie de diagnostic deținută în totalitate, și nu este nevoie să se facă o analiză ADN a restului familiei. În cazul în care o mutație în gena corespunzătoare este găsit, permite un diagnostic exact aproba de ereditate, determinarea genotipului pentru restul familiei împovărat.

Un alt avantaj al diagnosticului direct este considerat a identifica un purtător heterozigotă de mutații rele de la rude și părinți care au murit din cauza acestei boli. Acest lucru este valabil mai ales pentru bolile autosomal recesivă. Dezavantajele metode directe sunt de asemenea disponibile. Pentru a le aplica, trebuie să știți exact localizarea genei anormale, exon-intron structura spectrului și a mutațiilor. Nu toate bolile monogenice de azi au primit astfel de informații. metode directe informativeness nu poate fi considerată completă, deoarece una și aceeași genă poate avea un număr mare de mutații patologice care determina dezvoltarea de boli ereditare.

metode indirecte

Metodele indirecte în diagnosticarea ADN sunt folosite la toate, în alte cazuri, în cazul în care gena deteriorat nu este identificat, dar numai cromozomial, sau în cazul în care diagnosticul linie nu a dat rezultatul (se întâmplă, în cazul în care gena organizației complexe moleculare sau într-o mare măsură, în cazul în care există o mulțime mutații patologice). Metodele indirecte efectuat analiza segregare a markerilor polimorfici în familia alelice. Markeri găsite în aceeași regiune cromozomială sau locusul este strâns legată de boală și reprezintă deleții sau inserții, substituții punctiforme, se repetă, iar polimorfismul acestora se datorează diferite cantități de celule din bloc.

Cel mai convenabil pentru diagnostic considerate microsatelit și minisatellite polimorfisme indirecte, care sunt distribuite pe scară largă în genomul uman. valoarea lor exprimată în conținut ridicat de informații, în cazul în care deteriorarea distanței genetice dintre marker și gena nu este prea mare. In acest ultim caz, precizia de estimare este determinată în mare măsură de frecvența recombinării între marker polimorfic și daune. Metodele de diagnosticare indirectă furnizează, de asemenea, etapa preliminară obligatorie a frecvențelor alelelor ale studiului populației analizate în rândul pacienților și purtători de mutații, plus necesitatea determinării probabilității de recombinare a markerilor neechilibru și adeziune și alele mutante.

alte metode

segmente scurte de ARN-ului sau ADN-ului, precum și gena unic vizualizate în studiu microscopic nu poate fi, prin urmare, pentru a identifica mutațiile necesare diagnosticului genetic molecular. Există un „Proiectul genomului uman“, ca și alte progrese in genetica moleculara extins foarte mult posibilitatea de diagnosticul bolilor ereditare - atât pre- și post-natale. Aceste metode pot oferi depistarea precoce și de a face o poli- predictie si boli monogenice, a carui debut are loc la vârsta adultă. Din păcate, din cauza capacităților tehnice ale studiilor genetice moleculare sunt, uneori, dincolo de limitele etice care sunt stabilite în ceea ce privește moștenirea, mai ales atunci când diagnosticul este in adolescenta si copilarie.

anomalii cromozomiale structurale și numerice sunt cele mai frecvente cauze ale bolii si a cancerului, si multe malformatii. cromozomale trebuie să fie identificate, ceea ce este important pentru consiliere de familie - pentru a evalua prognoza, impreuna cu un risc de reproducere la sarcinile viitoare. analiza cromozomiala este „standardul de aur“ de diagnostic genetic, dar este limitat. Numai metodele de analiză genetică moleculară pot face mai mult, pentru că există clonarea tehnologiei bazate pe etichete fluorescente , capabile să sensibilitatea lor mare pentru a identifica modificari cromozomiale subtile care sunt imposibil de detectat clasice studii citogenetice. Aceste tehnici se extind din ce în ce capacitățile noastre de diagnostic, atunci când a examinat, copiii cu dizabilități de dezvoltare, retard mintal, cu multe alte boli ereditare.

constatări

Este foarte important pentru omenire au structura genei și funcția de cunoaștere, tipuri de variabilitate, capacitatea de a detecta boli ereditare care au avut loc în legătură cu dezvoltarea geneticii moleculare. Metodele sale au ca scop studiul moleculei de ADN - și atunci este normal, iar când acesta este deteriorat. Prepararea secvențelor de acid dezoxiribonucleic de nucleotide (ADN) se extinde în etape de la primirea mostrelor pentru a identifica fragmente individuale. Izolarea ADN-ului genomic din celulele, restrictie (lacrimare), amplificare (clonare), electroforeza a fragmentelor (care separă sarcina lor electrică și greutatea moleculară de gel de agaroză). Identificarea fragmentelor specifice localizate pe suprafața unei benzi discrete.

Apoi intra in filtre speciale, actul prin care trece fiecare fragment de hibridizare cu fragmente ADN donate sau sonde radioactive sintetice este un control, care va fi egală cu fiecare probă. Dacă schimbați poziția sau lungimea în comparație cu proba, în cazul în care un nou fragment sau dispărut - toate acestea sugerează că gena analizată a suferit restructurare în secvența de nucleotide. Există opt tehnici de bază de studii genetice moleculare: secventierea (determinarea secvenței ADN), reacția în lanț a polimerazei (creșterea numărului de secvențe), obținerea primerii de gene cunoscute, clonarea ADN, producerea moleculelor recombinante proteine derivate datorate moleculelor recombinante, creând un set complet (colecție bibliotecă) fragmente care au fost obținute prin utilizarea de restricție clonate.