Microscopie de fluorescenta: principiile metodei

Absorbția și reemisia fluidelor anorganice și organice suplimentare de lumină este rezultatul fosforescență sau fluorescență. Diferența dintre fenomenele este durata intervalului dintre absorbție și emisie a fluxului luminos. În cazul în care fluorescența acestor procese au loc aproape simultan, în timp ce fosforescente - cu o oarecare întârziere.

informații istorice

În 1852, om de știință britanic Stokes, descris pentru prima fluorescenta. El a introdus un nou termen , ca urmare a experimentelor cu fluorină, care emit lumină roșie în lumină ultravioletă. Stokes a remarcat un fenomen interesant. Se constată că lungimea de undă a radiației fluorescente este întotdeauna mai mare decât fluxul de lumina de excitație.

Pentru a confirma ipoteza în secolul al 19-lea au existat mai multe experimente. Ei au arătat că o varietate de probe fluorescențe sub influența luminii ultraviolete. Printre materialele, printre altele, fost cristale, rășini, minerale, clorofilă, medicamente brute, compuși anorganici, vitamine, uleiuri. Utilizarea directă a coloranților pentru teste biologice a început abia în 1930

microscopie de fluorescenta: descriere

Unele dintre materialele utilizate în prima jumătate a studiilor secolului 20 au prezentat specificitate mare. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Datorită performanței, care nu a putut fi realizată prin metode de contrast, metoda de microscopie de fluorescență a devenit un instrument esential in cercetarea biomedicala si biologica. La fel au fost obținute rezultate importante, și pentru materiale.

? Ce avantaje metoda de microscopie de fluorescență? Utilizarea noilor materiale, a devenit posibilă și selectarea componentelor submicroscopice de celule foarte specifice. microscopie de fluorescenta poate detecta molecule unice. O varietate de coloranți permit identificarea mai multor elemente. În ciuda rezoluției spațiale limitată a limitei de difracție a echipamentului, care, la rândul său, depinde de proprietățile specifice ale eșantionului, identificarea moleculelor sub acest nivel este de asemenea posibil. Diferite mostre după iradiere. Exponat autofluorescence Acest fenomen este utilizat pe scară largă în petrologie, botanică, industria de semiconductori.

caracteristici

Studia țesuturi animale sau agenți patogeni adesea complicate sau prea slabe sau foarte puternice autofluorescence nespecific. Cu toate acestea, valoarea în studiile capătă introducerea în componentele materialului excitat la o anumită lungime de undă și care emit intensitatea fluxului de lumină necesară. Fluorocromii acționează ca coloranți capabili în mod independent atașați la structuri (vizibile sau invizibile). Astfel, ei au o selectivitate ridicată la țintă, iar randamentul cuantic.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. microscopie de fluorescenta a fost utilizat pe scară largă de la apariția de coloranți naturali și sintetici. Ei aveau anumite profiluri de intensitate ale emisiei și de excitație și orientate spre ținte biologice specifice.

Identificarea moleculelor individuale

De multe ori, în condiții ideale, vă puteți înregistra o strălucire element separat. Pentru aceasta, printre altele, este necesar să se prevadă un zgomot suficient de scăzută a detectorului și fundal optic. molecula de fluoresceină la eșecul din cauza fotooxidare poate emite până la 300 de mii. Fotonii. La 20% eficiență de colectare a procesului și le poate înregistra într-o cantitate de aproximativ 60 de mii.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. microscopie de fluorescenta pe baza fotodiode de avalanșe sau multiplicare electronică, a permis cercetatorilor sa observe comportamentul moleculelor individuale , prin intermediul a doua, iar în unele cazuri chiar de minute.

complexitate

O problemă-cheie în favoarea suprimarea zgomotului de fond optic. Datorită faptului că multe dintre materialele utilizate în proiectarea de filtre și lentile prezintă unele autofluorescence, eforturile depuse de oamenii de știință din stadiile incipiente au fost orientate spre producerea de componente având o fluorescență scăzută. Cu toate acestea, experimentele ulterioare au condus la noi concluzii. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. În special, sa constatat că microscopie cu fluorescență, bazată pe reflecție internă totală, aceasta permite de a realiza un fundal redus și lumina de excitație de intensitate mare.

mecanism

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Principiile de microscopie fluorescenta, bazate pe reflexie internă totală este utilizarea de val evanescente sau efemeră. Aceasta are loc la limita dintre medii cu diferiți indici de refracție. În acest caz, fasciculul de lumină trece prin prisma. Acesta are un parametru de mare indice de refracție.

Prisma adiacentă soluției apoase sau a sticlei cu parametrul redus. În cazul în care un fascicul de lumină îndreptate la ea, la un unghi care este mai critică, fasciculul este reflectat în totalitate din interfața. Acest fenomen, la rândul său, provoacă valuri nonpropagating. Cu alte cuvinte, câmpul electromagnetic generat care pătrunde într-un mediu cu un parametru mai mic indice de refracție la o distanță mai mică de 200 de nanometri.

Val evanescent Intensitatea luminii ar fi suficientă pentru a excita fluorofori. Cu toate acestea, din cauza adâncimii sale extrem de mici, volumul său va fi foarte mică. Rezultatul este un fundal de nivel scăzut.

modificare

microscopie de fluorescenta se bazează pe reflecție internă totală, poate fi pus în aplicare cu epi-iluminare. Acest lucru necesită lentile cu apertură numerică ridicată (cel puțin 1,4, dar este de dorit ca aceasta a ajuns la 1,45-1,6) și parțial iluminat aparate câmp. Acestea din urmă se realizează cu o dimensiune mică spot. Pentru o mai mare uniformitate cu ajutorul unui inel subțire, care este blocat de o porțiune a fluxului. Pentru unghiul critic, după care există o reflexie totală, avem nevoie de un nivel ridicat de refracție al mediului de imersie în obiectiv și geamul de acoperire a microscopului.